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蘋果多酚氧化酶雙鏈RNA干擾(RNAi)研究

來源: 發布時間:2017-11-25 07:19:00 瀏覽次數: 【字體:

曹艷紅 章 鎮 姚泉洪 彭日荷 熊愛生 李 賢

蘋果多酚氧化酶雙鏈RNA干擾(RNAi)研究

實驗生物學報

2004

37(6):487~493.

摘要:(    摘  要  以成熟蘋果果實的RNA為模板,經RT-PCR擴增并克隆蘋果多酚氧化酶(APPO)長度為710bp的反義、正義基因片段。以副球菌中類胡蘿卜素合成有關的(crtW+crtY)融合基因片段YYT為間隔區,將APPO反義基因片段、YYT和APPO正義基因片段串聯,將構成全長為2444bp的DNA插入到植物雙元載體pYPX145中,構成可表達蘋果多酚氧化酶雙鏈RNA的植物雙元載體pYF7704。該載體外源基因表達單元的兩端含兩個煙草核基質結合區(SAR)序列,利于轉基因的穩定遺傳。以根癌農桿菌介導的葉盤轉化法轉化蘋果栽培品種紅富士,通過50mg/L卡那霉素篩選和GUS檢測,獲得了轉基因植株。通過熒光定量RT-PCR檢測,結果顯示轉基因蘋果植株內多酚氧化酶基因的干擾效果達91.69%以上,研究結果證實多酚氧化酶雙鏈RNA干擾在轉基因蘋果上是可行的。 
    關鍵詞  雙鏈RNAi; 蘋果多酚氧化酶; 載體構建; 蘋果

RESEARCH ON APPLE POLYPHENOL OXIDASE DOUBLE-STRANDED RNA(RNAi)

Cao Yanhong1,2)  Zhang Zhen1)  Yao Quanhong2)  Peng Rihe2)  
Xiong Aisheng2)   Li Xian2)
 (1)Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;
 2) Shanghai Key Laboratory of Genetics and Breeding, Agri-biotechnology Research Center, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201106)

    Abstract   Antisense and sense gene fragments (710 base pairs) of apple polyphenol oxidase (APPO) gene were obtained by RT-PCR amplification, using the total RNAs isolated from ripen apple fruit as the template. These two fragments were ligated by a 1000bp spacer, YYT(crtW+crtY fusion ) gene, which is relative to carotenoid synthesization in subcocci. The full-length 2444bp-target gene was then inserted into plant binary vector pYPX145 to generate the recombinant plasmid pYF7704, which carried the expression unit of APPO dsRNA. The characteristic of the vector is that at both ends of the target gene there is a SAR sequence, which is beneficial to the stable heredity of the transgene. pYF7704 was transformed to apple (Malus domestica) var. Red Fuji via Agrobacterium tumefaciens mediated leaf disc transformation. With the selection of Karamycin and GUS detection assays, transgenic plants of APPO dsRNA were obtained. The results of FQ-RT-PCR indicated that APPO mRNA level was supressed to 91.69% in transgenic plants compared to wide plants. The data suggested that dsRNA technology on the apple polyphenol oxidase is feasible to be utilized in transgenic plants.
    Key words  Double-stranded RNA; Polyphenol oxidase (PPO); Vector construction; Apple (Malus domestica) 



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